發(fā)布日期：2018-06-27

　　Anal Chem雜志最新刊出了一篇浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院/轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院王本老師組報道的外泌體定量新技術(shù)的文章，該文章第一作者是實(shí)驗(yàn)室博士后田慶常博士。

　　外泌體是細(xì)胞分泌的具有磷脂雙分子層的納米囊泡，其膜性質(zhì)與細(xì)胞膜類似。基于這一性質(zhì)，我們利用細(xì)胞表面工程技術(shù)對外泌體膜進(jìn)行了有目的的修飾。

　　目前流行的數(shù)字PCR技術(shù)是用來定量檢測核酸的一種技術(shù)，其基本原理是將有限的DNA分子隨機(jī)分配到大量小室中，在小室多于DNA分子的情況下，每個小室中的核酸分子多于一個DNA分子的概率非常低，然后對眾多小室中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果是帶有DNA分子的小室會呈現(xiàn)陽性信號，而沒有DNA分子的小室呈現(xiàn)陰性信號。最后通過計數(shù)小室中陽性孔的量來計數(shù)原始的DNA濃度。

　　這篇文章中，我們將此數(shù)字檢測的原理用于外泌體檢測。外泌體是處于30-150 納米左右的納米顆粒，其在液體溶液中具有很好的分散性，在芯片中也像核酸分子一樣隨機(jī)分配，因此可以利用數(shù)字檢測的方法來對外泌體進(jìn)行定量。

　　工作原理如圖所示，能插入磷脂雙分子層的類磷脂分子（BAM）與合成的DNA分子合成為BAM-DNA分子。然后BAM-DNA被用于標(biāo)記外泌體，此標(biāo)記過程簡單易操作。標(biāo)記完成的溶液中可能存在大量的未標(biāo)記到外泌體上的BAM-DNA分子，需進(jìn)一步的進(jìn)行分離。本工作利用100 kd的超濾管用于分離標(biāo)記的外泌體和未標(biāo)記的BAM-DNA（分子量20 kd左右）分子。

　　標(biāo)記且純化后的外泌體帶有目的DNA分子，通過核酸檢測的方法可以通過檢測DNA分子來檢測標(biāo)記的外泌體。本文章采用了一種等溫方法來檢測外泌體表面的DNA。

　　標(biāo)記后的外泌體被分配到芯片中的小室中，基于上述的數(shù)字檢測的方法，經(jīng)過核酸擴(kuò)增反應(yīng)，帶有外泌體的小室，會呈現(xiàn)陽性信號，而其他的小室呈現(xiàn)陰性信號，通過計數(shù)這些“0101011”的數(shù)字信號而進(jìn)行外泌體計數(shù)，實(shí)現(xiàn)對總外泌體的定量。

　　此外，我們還可以對總外泌體中的特異性外泌體進(jìn)行抗體-DNA標(biāo)記，通過檢測抗體-DNA而對特異性的外泌體進(jìn)行檢測和定量。

　　目前外泌體定量一般采用動態(tài)光散射的方法進(jìn)行納米顆粒計數(shù)，該技術(shù)設(shè)備昂貴且稀少，不利于大規(guī)模研究的開展。而該文報道的方法以數(shù)字PCR技術(shù)為啟發(fā)，建立了一種納米囊泡的定量方法，期望該方法進(jìn)一步發(fā)展能將DNA定量技術(shù)和設(shè)備用于外泌體定量，為基礎(chǔ)研究和臨床診療中的外泌體檢測提供一種簡單易行的方法。

來源：材料轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)