發(fā)布日期：2018-05-17
本文轉(zhuǎn)載自“生命奧秘”，原標(biāo)題：以CRISPR技術(shù)為平臺(tái)打造的新一代診斷技術(shù)。
快速且準(zhǔn)確的診斷感染性疾病是提升臨床診療水平，以及指導(dǎo)感染性疾病防控和公共衛(wèi)生工作，避免疫情大范圍傳播的關(guān)鍵，這一點(diǎn)無(wú)論對(duì)于現(xiàn)代化的大型醫(yī)療中心，還是在缺醫(yī)少藥的偏僻鄉(xiāng)鎮(zhèn)醫(yī)院，都是非常重要的。最理想的診斷方式應(yīng)該是價(jià)格低廉、準(zhǔn)確性高，并且是快速的，而且還應(yīng)該操作簡(jiǎn)便（無(wú)需專(zhuān)業(yè)人士操作即可使用），以及無(wú)需專(zhuān)業(yè)設(shè)備和基礎(chǔ)設(shè)施要求（比如電力等條件）。對(duì)于埃博拉病毒（Ebola virus）和中東呼吸綜合癥病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus）這類(lèi)出現(xiàn)在偏僻地點(diǎn)，但會(huì)導(dǎo)致全球大范圍傳播的致病性病毒而言，如果有了這種理想中的檢測(cè)技術(shù)，就能夠幫助醫(yī)務(wù)人員在早期發(fā)現(xiàn)患者，將其隔離，避免疫情擴(kuò)散，同時(shí)也可以給患者爭(zhēng)取到更多及時(shí)治療的機(jī)會(huì)。
研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌和古生菌（archaea）等原核生物（prokaryotes）都具有先天的適應(yīng)性免疫機(jī)制（heritable adaptive immunity），而這套免疫系統(tǒng)都是以最近非常熱門(mén)的基因編輯技術(shù)CRISPR-Cas系統(tǒng)為基礎(chǔ)的。近期《科學(xué)》（Science）雜志已經(jīng)介紹了Chen科研團(tuán)隊(duì)、 Myhrvold科研團(tuán)隊(duì)和Gootenberg科研團(tuán)隊(duì)的工作。他們分別利用CRISPR-Cas技術(shù)開(kāi)發(fā)了革命性的分子診斷新技術(shù)，以用于發(fā)現(xiàn)人體標(biāo)本里的寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）、登革病毒（Dengue virus, DENV）和人乳頭瘤病毒（human papillomavirus, HPV）。同時(shí)他們也以肺癌患者的循環(huán)DNA（circulating cell-free DNA）為標(biāo)本，對(duì)基因突變這類(lèi)非傳染性致病因素進(jìn)行了診斷。
原核生物在它們基因組的CRISPR位點(diǎn)里儲(chǔ)存了大量的感染性病原體（比如噬菌體、質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子等）的遺傳信息，這些遺傳信息就是原核生物自身的“抗體（適應(yīng)性免疫記憶）”。Cas蛋白通過(guò)適應(yīng)（adaptation）、轉(zhuǎn)錄出crRNA和干擾（interference）等步驟，完成原核生物的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。在適應(yīng)階段，外源性遺傳物質(zhì)被原核生物加工處理及挑選，最后整合進(jìn)CRISPR位點(diǎn)，打下深刻的免疫記憶烙印，為今后再次遭遇該感染源做好準(zhǔn)備。前體crRNA是一種長(zhǎng)鏈RNA前體分子，它成熟成為crRNA之后，可以指引Cas蛋白剪切外源遺傳物質(zhì)的互補(bǔ)鏈，這就是干擾步驟，最終使外源遺傳物質(zhì)降解，消滅外來(lái)感染源?？蒲腥藛T徹底弄清楚這一套原核生物免疫機(jī)制之后，就開(kāi)發(fā)出了新的分子診斷技術(shù)。
Chen的課題組發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CRISPR-Cas12a蛋白以序列特異性方式切割dsDNA時(shí)，還會(huì)誘導(dǎo)出很強(qiáng)的非特異性ssDNA反式切割效應(yīng)（trans-cleavage）。根據(jù)這種特點(diǎn)，他們開(kāi)發(fā)出了一種以臨床常規(guī)采樣標(biāo)本為檢測(cè)對(duì)象，快速鑒定HPV16、18型致癌病毒的新技術(shù)。通過(guò)肛門(mén)拭子（anal swabs）標(biāo)本提取出HPV病毒的dsDNA，經(jīng)過(guò)等溫預(yù)擴(kuò)增（isothermal preamplification），然后利用重組多聚酶擴(kuò)增法（recombinase polymerase amplification, RPA）進(jìn)行擴(kuò)增。這種DNA擴(kuò)增技術(shù)是一種快速，而且不需要專(zhuān)門(mén)儀器的DNA擴(kuò)增技術(shù)。接著，他們通過(guò)Cas12a-crRNA復(fù)合體與擴(kuò)增的HPV dsDNA結(jié)合，將其降解，同時(shí)誘發(fā)dsDNA反式降解反應(yīng)，以激活結(jié)合在dsDNA分子上的熒光報(bào)告因子（fluorescent reporter），發(fā)出熒光，完成整個(gè)檢測(cè)。這種新型診斷技術(shù)名為DNA內(nèi)切酶靶向的CRISPR反式報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)（DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter, DETECTR）。該技術(shù)可以用來(lái)快速、且準(zhǔn)確地檢測(cè)各種亞型的HPV病毒。而且由于其快速、準(zhǔn)確、便捷的特點(diǎn)，尤其適合世界衛(wèi)生組織推薦的大規(guī)模普查工作。
Myhrvold等人開(kāi)發(fā)的檢測(cè)方法則是將采自患者的臨床檢測(cè)樣品里的病毒核酸直接釋放出來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，略過(guò)了常規(guī)檢測(cè)工作中的核酸提取這個(gè)步驟。這種方法被稱(chēng)作不經(jīng)核酸提取熱處理樣品滅活核酸酶技術(shù)（heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases, HUDSON）。這種技術(shù)能夠大量滅活人體體液里的核糖核酸酶（ribonucleases），同時(shí)也可以使病毒的衣殼破裂，釋放出病毒的核酸分子。Myhrvold等人還使用了以Cas13蛋白為基礎(chǔ)的核酸檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)——特異性高靈敏度酶報(bào)告系統(tǒng)（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking, SHERLOCK）。與DETECTR系統(tǒng)類(lèi)似，SHERLOCK系統(tǒng)也利用了RPA和Cas13蛋白，誘導(dǎo)出（非CRISPR）核酸切割反應(yīng)。
在SHERLOCK系統(tǒng)里，結(jié)合了熒光報(bào)告因子的RNA被切割之后會(huì)釋放出熒光信號(hào)，該熒光信號(hào)再經(jīng)酶的放大，從而極大地提高了這種檢測(cè)方法的靈敏性。Myhrvold等人將HUDSON技術(shù)和SHERLOCK系統(tǒng)結(jié)合起來(lái)，開(kāi)發(fā)出了一種高靈敏同時(shí)高特異性的檢測(cè)方法，可用于直接對(duì)體液（包括尿液、血液、唾液、血清和血漿等）中的登革病毒和寨卡病毒進(jìn)行檢測(cè)，在1至2個(gè)小時(shí)內(nèi)給出檢測(cè)結(jié)果。而且樣品的制備過(guò)程也很簡(jiǎn)單，同時(shí)也不需要很復(fù)雜的設(shè)備。在中南美洲的很多地區(qū)，登革病毒和寨卡病毒都非常常見(jiàn)，而且臨床表現(xiàn)也都差不多。如果孕婦感染了寨卡病毒，那么將極容易產(chǎn)下先天畸形的孩子，而且這種病毒可性傳播，因此對(duì)孕婦和她們的丈夫進(jìn)行檢測(cè)就顯得尤為重要。這套HUDSON——SHERLOCK檢測(cè)技術(shù)可以很好地區(qū)分登革病毒、寨卡病毒、黃熱病毒（yellow fever virus, YFV）這些在巴西多地流行，并導(dǎo)致嚴(yán)重疫情的病原體。該技術(shù)還可以很好地區(qū)分四種不同亞型的登革病毒，還能夠?qū)Σ煌恼ú《具M(jìn)行單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphisms, SNP）分析。這種功能可被用于多種SNP分析，比如耐藥相關(guān)SNP、毒力相關(guān)SNP、傳染性相關(guān)SNP等，從而幫助我們發(fā)現(xiàn)，并跟蹤新出現(xiàn)的病原體。Myhrvold等人還將SHERLOCK報(bào)告系統(tǒng)的熒光信號(hào)改造成了類(lèi)似于早孕試紙條式的報(bào)告系統(tǒng)，這非常適合在檢測(cè)現(xiàn)場(chǎng)（point-of care）使用。
Gootenberg團(tuán)隊(duì)使用的也是SHERLOCK技術(shù)，不過(guò)他們對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn)，開(kāi)發(fā)出了SHERLOCKv2檢測(cè)系統(tǒng)。這種系統(tǒng)只需通過(guò)一次反應(yīng)便可同時(shí)檢測(cè)三種ssRNA靶標(biāo)和一種dsDNA靶標(biāo)。他們對(duì)17種CRISPR-Cas13a酶和CRISPR-Cas13b酶進(jìn)行了生化檢測(cè)，然后從中挑選出3種有特殊切割活性的酶，再輔以Cas12a酶及RPA系統(tǒng)，最終開(kāi)發(fā)出了這種能夠在90分鐘內(nèi)同時(shí)檢測(cè)寨卡病毒ssRNA、人工合成ssRNA（synthetic ssRNA）、登革病毒ssRNA，以及人工合成dsDNA的檢測(cè)系統(tǒng)，而且檢測(cè)結(jié)果還是容易判讀的可視化結(jié)果。這種能夠同時(shí)檢測(cè)RNA和DNA的SHERLOCKv2技術(shù)非常適合用于肺炎致病病原體的鑒定。我們知道肺炎是全世界幼兒死亡的首要病因。不論是DNA病毒或者RNA病毒感染，還是同時(shí)合并了細(xì)菌感染導(dǎo)致的肺炎，都可以通過(guò)這種方法進(jìn)行檢測(cè)。這種便捷、廉價(jià)、方便的就地肺炎診斷技術(shù)一定可以幫助偏遠(yuǎn)地區(qū)的肺炎患者及早獲得相應(yīng)的（抗菌或抗病毒）醫(yī)療救助。
另外一種SHERLOCKv2技術(shù)可以對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行高靈敏度的定量檢測(cè)。這種簡(jiǎn)便而又準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)可以對(duì)醫(yī)療資源相對(duì)落后的地區(qū)的艾滋病患者進(jìn)行HIV病毒滴度監(jiān)測(cè)，以判斷抗病毒療法的療效，從而改善艾滋病患者的診療狀況。這種SHERLOCKv2技術(shù)還可以用來(lái)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者血液中的DNA分子的突變情況，檢測(cè)結(jié)果可以是熒光讀數(shù)，也可以是側(cè)向流免疫層析（lateral flow assays）方式，因此也可以用于液體活檢（liquid biopsy）。Gootenberg團(tuán)隊(duì)在體外概念驗(yàn)證試驗(yàn)中，還成功應(yīng)用SHERLOCKv2技術(shù)開(kāi)展了基因編輯治療，糾正了結(jié)腸癌突變基因，同時(shí)也利用SHERLOCKv2技術(shù)確定了被成功修復(fù)的突變基因的數(shù)目。
這些新開(kāi)發(fā)的診斷技術(shù)還需要與傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行對(duì)比，以確保它們的靈敏性和特異性，同時(shí)還需要進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試，看看是否滿(mǎn)足臨床檢測(cè)需要，因?yàn)椴煌瑱z測(cè)環(huán)境，以及不同操作者都有可能影響檢測(cè)結(jié)果。一旦通過(guò)了這些測(cè)試，這些新型的檢測(cè)技術(shù)就可以投入實(shí)際應(yīng)用，提高偏遠(yuǎn)地區(qū)的診療水平。在那些醫(yī)療條件落后的地區(qū)，不明原因發(fā)熱的診治是最常見(jiàn)，又是最難診治的，這些疾病也是死亡率很高，傳播范圍很廣的疾病。比如，每年全世界因?yàn)榻Y(jié)核桿菌感染會(huì)使130萬(wàn)人死亡，因此結(jié)核病也是死亡率最高的疾病，而早期發(fā)現(xiàn)、早期處置其實(shí)是可以避免這些患者死亡的。
這些檢測(cè)技術(shù)既可以用來(lái)研究致病病原體的耐藥問(wèn)題，指導(dǎo)臨床用藥；也可以分析致病病原體的活力（viability），以指導(dǎo)感染疾病的防控工作；還可以擴(kuò)展檢測(cè)范圍，讓糞便、呼吸道分泌物、腦脊液等標(biāo)本都成為檢測(cè)樣品，以用于明確腸炎（enteritis）、肺炎（pneumonia）和腦膜炎（meningitis）等疾病的病因。隨著技術(shù)的發(fā)展，根據(jù)準(zhǔn)確性、可靠性、簡(jiǎn)便性、檢測(cè)速度、靈活性、費(fèi)用等方面的考慮，還可以將這些檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于傳染性疾病和非傳染性疾病的檢測(cè)，也可以應(yīng)用于臨床、實(shí)驗(yàn)室，以及野外等多種場(chǎng)合。
原文檢索：
Daniel S. Chertow. (2018) Next-generation diagnostics with CRISPR. Science, 360: 381-382.
來(lái)源：生命奧秘/Eason
